Samenvatting MCB - Lecture 1. Structuur van DNA, organisatie van chromatine in de kern - Studeersnel (2023)

Lecture 1.

Structuur van DNA, organisatie van chromatine in de kernBasisbegrippen: - Opgebouwd uit nucleinezuren - Dubbelstrengs DNA ontstaat door waterstofbruggen tussen de basen - Helix antiparallel - Altijd 5 -> 3 koppeling via phospho-diesters - Biosynthese van 5 naar 3 richting - Polymeren via covalente verbindingen

Organisatie DNA in eukaryotische cel. - Prokaryoten: o Niet geordend ingericht. Dit is mogelijk omdat het maar 1 cel is, dus controle over genexpressie is minder belangrijk. Het DNA bevat namelijk (bijna) geen stukken die de cel niet nodig heeft of die niet wenselijk zijn. o Er is geen kern o Transcriptie nauwelijks gecontroleerd - Eukaryoten: o Geordend ingericht. Omdat een eukaryoot meerdere soort cellen heeft is het belangrijk om een geordende inrichting te hebben zodat de genen beter gereguleerd kunnen worden. Hierdoor gaat Bv. een huid cel niet eiwitten van een lever cel maken o In een kern o Transcriptie goed gecontroleerd

Chromosomen.Chromosomen is typerend voor eukaryoten. Het grootste deelgenen op de chromosomen is niet coderend.Kenmerken: - Gepaarde chromosomen - Telomeren/centromeren - Origin of replication - Hetrochromatine/euchromatineAls chromosomen compact zijn opgerold krijg je de structuren rechtste zien. Dit heeft een typerend banden patroon.De verhouding DNA in eukaryoten: 25% genen (intronen + exonen),75% virale addities (transposons, repeated sequences etc).Chromosoom translocatie:

Chromatin: Nucleosome. - Een nucleosome is een histon met DNA er omheen gewikkeld (2 turns en +-200 nucleotines). Tussen deze nucleosomen zitten linker DNA. - Meerdere nucleosomen samen in een ‘bead on a string’ noem je een chromatine. - De positieve lading van histonen attract de negatieve lading van DNA. Hierdoor zit het DNA sterk om het histon gewikkeld. - Een histon bestaat uit de eiwitten: 2x H2A, 2x H2B, 2x H3 en 2x H

Histone fold. - Histon fold bestaat uit de stukken van de histon eiwitten zonder de n-termini - De histon folds gaan in elkaar zitten. De Alpha helix deze eiwitten (de dikkere stukjes in het plaatje) gaan in elkaar zitten: histon handshake (zie B en C) - de n-termini kunnen gemodificeerd worden. Dit geeft een bepaalde functie met zich mee. Ook kunnen ze met elkaar interacten

Nucleosomen.Assemblage nucleosome: Eerst worden H4 en H3 gevormd tot eencomplex (met histon handshake). Tegelijkertijd worden H2A en H2Been complex samen, ook door de histon handshake. Daarna wordthet DNA gewikkeld rond het H3+H4 complex. Als laatste komt hier

Euchromatine en hetrochromatine.Hetrochromatine: kan niet uitgelezen worden, compact om histonEuchromatine: kan uitgelezen worden, losser om histon

Positional effect variegation: verspreiding van een modificatie. (schakering genexpressie tegenovergen positief). Na differentiatie moeten enkel specifieke genen afgelezen worden. Dit zorgt voororganisatie in hetro en euchromatine BV: Bij cel proliferation wordt de verspreiding vanhetrochromatine groter, want je wil minder aflezen doordat je gaat delen.

Heterochromatine probeert zich uit de spreiden naar nabijgelegen sequenties. Dit kan zorgen voorgene-silencing.

Regulatie hetro- en euchromatine: Uitgelezen van n-terminimodificaties van de histonen.Histon code: post translationele modificaties op n-termini die coderen voor een functie.Posttranslationele modificaties zorgen dat er een bindingsplaats komt voor specifieke eiwit eiwitinteractie domeinen.

1. Acetylering van lysine (HAT): acetyl-lysine. Van positieve lading naar neutrale lading;
2. Deacetylering van lysine (HDAC): verwijdert een acetyl-groep van lysine. Zorgt ervoor dat DNA strakker rondom histonen kunnen liggen.
3. Methylering van lysine: mono- di- of trimethyl-lysine. Heeft invloed op de herkenning door andere eiwitten en het hydrofobe karakter, maar niet op de lading.
4. Phosphorylering van serine: phosposerine. Van neutrale lading naar positief.

Een COMBINATIE van deze modificaties geeft een bepaalde functie (zoalsbv losser maken DNA om histon).

Histon code.De histon code is van invloed op transcriptie van genetische informatie.Deze wordt gecodeerd door de chemische modificaties van dehistoneiwitten (n termini). wordt herkend en uitgelezen door code-reader complexes. (geholpen door scaffold proteins). Deze complexenherkennen individuele onderdelen van de histonen en hebben hiervoorspecifieke pockets. Er wordt niet alleen naar deze onderdelen gekekenmaar ook naar de DNA sequentie eromheen (de context).

Verspreiding van histon code: door chromatine remodelling reader writercomplex. Dit kopieert histon code naar bijgelegen nucleosomen in een

soort chain reaction.

Deze kunnen gestopt worden door barrier proteins. kan op verschillende manieren zoalsenzymatisch of fysiek.

• Het gehele genoom van de mens is gesequenced.
• Ongeveer 30,000 genen in humaan genoom. o Maar 1% daarvan is exon o Per 1 miljoen jaar verandert 0% van de basenparen in het genoom. o 5% van het genoom is geconserveerd (exonen + regulatie + RNA sequenties aangezien deze het belangrijkst zijn om mee te krijgen)

Hierboven zie je links in het plaatje de repeated sequences. Deze bevatten transposons, die gendiversiteit grotendeels bepaald hebben. Transposons kunnen van plek veranderen op hetchromosoom, maar hebben geen functie.

Multi-Species Conserved Sequences: sequenties die niet coderen voor een eiwit (intronen), maar weleen belangrijke regulerende functie heeft.

DNA mutaties. - error rate in DNA replication: 1:10^10 nucleotides. - Processen die resulteren in verandering van het genoom: o Deletie, inversie, duplicatie, transpositie, DNA schade - De fouten in DNA zijn belangrijk voor evolutie  survival of the fittest. o Deze fouten moeten wel in geslachtscel voorkomen, anders wordt het niet doorgegeven. - Mutaties in genen hebben ook effect op ander DNA (een ketting reactie waarbij meer mutaties ontstaan na 1 andere mutatie).

Intronen hebben meer vrijheid voor mutaties dus hier zit ook de meeste diversiteit in. In exonen noujuist weinig omdat fouten in eiwitten drastische gevolgen hebben.Purifying selection: coderende sequenties veranderen veel minder. Het huidige gen is optimaal enveranderingen zullen veelal negatief zijn (conservatie is dus erg sterk).Evolutie.Hiernaast in het plaatje kun je zien dat mensen 5miljoen jaar geleden zich afsplitste van de chimpansee.Hierbij is echter maar een heel klein verschil in basen tevinden (maar 0%). Als je dan gaat kijken naar dezeverschillen zie je dat sommige subsituties van bp nogniet eens een ander aminozuur geven (stille mutatie).Daardoor is het verschil dus heel klein.

Kloksnelheid van DNA: hoeveelheid DNA letter verschiltussen sequences van 2 soorten. - Dit zegt iets over hoeveel tijd er voorbij is gegaan sinds hun laatste gemeenschappelijke voorvader in leven was.

• Bij mensen neemt deze snelheid af.
• Kijk vooral naar genen die sloom evalueren om goed terug in het verleden te kunnen kijken

Vergelijking mens vs muis. - 80 miljoen jaar geleden leefde de common ancestor - Mens: 23 chromosomen, muis: 20 chromosomen o Intronen zorgen voor vergroting of verkleining van genoom, dus gaan ze weg of komen ze er bij - Zelfde aantal genen - Bijna geen homologie in intronen  niet belangrijk voor overleving - Sterke homologie in exonen  wel belangrijk voor overleven o Het gedrag van mensen en muizen zijn ook in een zekere zin sterk hetzelfde, zoals eten drinken en vorm van voorplanting. Het is dus logisch dat de exonen zo op elkaar lijken

Development van bepaalde functies over miljoenen jaren:

Gen duplicatie. - Belangrijk voor het ontstaan van nieuwe genen: door meerdere genen die voor hetzelfde coderen is de kans groter dat er een mutatie ontstaat. Als een van deze gemuteerde genen dan actief wordt, zal er een andere functie onstaan. o Gen inactivatie: creeert een pseudogen die aanwezig blijft maar door mutatie inactief gemaakt (junk DNA) o Gen diversificatie: beide genen zijn actief maar in verschillende weefsels of ontwikkelingsstadia. - Bv: foetus gebruikt andere hemoglobine dan volwassene

Daarnaast zijn er meerde origins of replication op het DNA, zodat replicatie parallel kan gebeuren.

DNA replicatie.DNA wordt in 53 richting gerepliceerd envan de template afgelezen (aflezen in 35).Hierbij wordt de lagging strand gevormd doorlosse fragmenten: Okazaki fragmenten.

Belangrijke eiwitten bij DNA synthese: - Helicase: ontwind het DNA onder invloed van ATP. Het is een soort ATP motor - Clamp eiwitten: een ring rondom het dubbelstrengs DNA, houdt DNA-polymerase vast. - Primase maakt primers die door DNA polymerase herkent worden om te binden en replicatie te starten. Het brengt 2 start nucleotide samen en synthetiseerd daarna een primer - Single strand binding protein: zit vast aan de backbone van DNA die ervoor zorgt dat het single strand DNA bij beschermd wordt en niet reageert of ophoopt.

Lagging strand: hier moet de synthese steeds opnieuw beginnen. Dit wordt gedaan door primers diedoor primase gemaakt worden en door DNA polymerase herkend worden. Deze RNA primer wordt erlater weer afgeknipt.

Totaal Plaatje DNA replicatie:

Strand directed mismatch repair.Vindt plaats direct na DNA synthese en kan mogelijke fouten nog herstellen. - MutS: herkent mismatches in basenparen o Wordt herkend aan A’s die nog niet gemethyleerd zijn. - MutL: knipt de sequentie rondom mismatch om de fout te verwijderen. DNA polymerase vult het gat vervolgens.

DNA topoisomerases.Houdt DNA uit de knoop. Bij ontwinding door helicase komt er een druk testaan op het nog niet ontwonden DNA. Het wordt ‘super coiled’, waarvan dedruk vanaf moet worden gehaald. Dit doet DNA topoisomerase - Type 1: verbreekt een strand in dubbelstrengs DNA waardoor de mechanische stress ‘ released’ is. - Type 2: verbreekt dubbelstrengs dna aan beide strands, maar houd het noig wel vast. (ATP!)

Replicatie bubbel.

Lecture 3.

DNA schade.DNA schade: - Spontane hydrolyse - Reactieve radicalen door oxiddatieve fosforylering - Stralingsschade - Defecten in DNA repair system (kan erfelijk zijn: borstkanker)Van deze schade wordt 99% herstelt door het DNA repair system.RNA is een stuk gevoeliger voor hydrolyse omdat het een extra -oh groep heeft om mee te reageren.DNA is dus een stuk stabieler.

Veelvoorkomende mutaties zijn: - Depurinering: door hydrolyse komt de base los van de backbone (18000 x per dag) o Resulteert in een deletie van een base paar doordat deze mist. - Deaminering van cytosine: amine komt vrij van base door hydrolyse waardoor deze kan veranderen in een andere structuur (cu) (100x per dag) o Gevolg deaminering: bij DNA synthese wordt er een correcte strand gesynthetiseerd en een gemuteerde strand met de verkeerde base. G met C en U met A.Zonder herstel zullen de verkeerde baseworden ingebouwd.

DNA reparatie methodes.

Base excision repair: Herkenning van vreemdebasen door een flipping out mechanisme. Hetflipping out mechanisme draait de nucleotidenaar buiten toe. - DNA glycolase verwijdert een base groep - Hierna doet AP endonulcease de suikergroep en de fosfaat groep verwijderen. - DNA polymerase vult het gat op en DNA ligase fixt de nick die door de deaminering ontstond

Nucleotide excision repair: Herkent verstoring van normale lineaire DNA structuur. Bijvoorbeeld alsgevolg van UV straling waarbij een dimeer ontstaat tussen basen naast elkaar. - Als eerst zoekt excision nulcease voor een fout in de DNA structuur. Het hydrolyseert hierbij vervolgens een stuk sequentie rondom deze fout. - DNA helicase verbreekt de bindingen van de base en haalt het stuk sequentie weggehaald.

• De complementaire strand wordt dan gebruikt om de sequentie weer aan te vullen en DNA ligase ligeert het gat.

Cisplatin: zorgt ervoor dat genen nietuitgelezen kunnen worden doordat hetbind aan de DNA backbone. Het wordtgebruikt in kanker bestrijding om bepaaldeceldelening bevorderende genen uit tezetten. Cellen kunnen resistent worden.

Deaminering van nucleotides.Bij de deaminering van nucleotides wordtde structuur veranderd door een aminegroep te vervangen met een carbonylgroep. De veranderingen zijn: - A hypoxanthine - Gxanthine - T geen verandering - C U - C-methyl  T (deze fout kan niet worden herkend, bestaat uit 30% van de punt mutaties)

Reparatie van dubbelstrengs breuken.

Dubbelstrengse breuken kunnen op 2 manieren gerepareerd worden: homoloog of non-homoloog.Non-homologe recombinatie:

T-loops zorgen voor extra bescherming van detelomeer. Is door shelterin’s zo gemaakt.

Homologe recombinatie tijdens meiose.Homologe recombinatie gebeurt waneer de vader enmoeder chromosoom zijn verdubbeld en langs elkaarliggen. Op dat moment kan er gene crossover ofgene conversion gebeuren. Hierbij wordt de anderschromosoom gebruikt om bij homologe recombinatie hetDNA gat op te vullen. 10% van de tijd wordt hierbij DNAuitgewisseld waardoor er genetische variatie ontstaat. Bijde andere 90% gebeurd er geen uitwisseling en krijgen zede oude strand weer terug.

• Gene crossover: hierbij gaat de ene chromosoom over in de andere. Bewuste breuk die geintroduceerd kan worden door Mre11 en Spo enzymen. Na deze knip volgt exonuclease activiteit plaats. Hierna kan dus de 10% of 90% gebeuren van eerder.
• Gene conversion: een klein stukje DNA wordt maar uitgewisseld. o Hierbij kan het DNA niet 100% een match zijn omdat dat niet perse bij homologe recombinatie hoeft. Dit wordt gefixt door mismatch excision repair.

Het migreren van de branch points wordt gekatalyseerd door DNA helicase.

Transpositie.Mobiele genetische elementen (jumping genes/selfish DNA). Homologie nietvereist. Is verantwoordelijk voor meer dan 50% van evolutie van DNA.

Vormen van transpositie: - DNA only transposons (herkenning aan short inverted repeats aan elk eind) - Retroviral like transposons (herkenning aan directed repeated long terminal repeats) - Nonretroviral retrotransposons (herkenning aan poly A staart aan 3’eind van RNA transcript)

DNA only transposons: mechanisme waarmee bacterien resistant kunnen worden. Cut and pastemechanisme: - Short inverted repeats worden herkent door eiwitten en maken hier een transposome complex van - Hierna wordt deze loop uit het dsDNA gehaald en terug aan elkaar geplakt zonder de transposon ertussen. - Deze transposon beweegt dan naar een stukje (semi)random DNA, waar het wordt ingeplakt.Groot deel van deze transposons niet meeractief.

Retroviral like transposons: werken voor hetgrootste deel hetzelfde als retroviral transpositie,maar produceren uiteindelijk geen virale eiwitten. - Virus infecteert gastheer en insert zijn RNA en reverse transcriptase - Dit RNA wordt door reverse transcriptase omgezet naar DNA en geintegreerd in het genoom.

Nonretroviral retrotransposons: langs eentransposon wordt RNA gevormd. Deze codeert voor een eiwit

• Dit complex bindt (zwak) aan DNA opzoek naar een promotor sequentie (TATA-box) om transcriptie te starten. RNA polymerase trekt plaatselijk het dsDNA uit elkaar om een transcriptie bubbel te vormen.
• De promotor kan verschillen en bepaalt daardoor deels de efficiëntie van transcriptie.
• Transcriptie gaat van DNA naar mRNA naar eiwit. Hierbij wordt alles gevormd in een compartiment waarbij het eiwit al gevormd kan worden tijdens de synthese van mRNA.
• Sigma laat los nadat er +- 10 nucleotiden zijn gevormd van het mRNA. RNA polymerase laat het los door de ‘hairpin’ structuur. Deze hairpin zit gecodeerd in het DNA.
• RNA polymerase heeft geen primer nodig dus is minder nauwkeurig.

Eukaryoten: - Veel verschillende vormen van RNA. Hiervan is het meeste rRNA - Er zijn 3 polymerases bij eurkaryotische transcriptie. RNA polymerase I, II en III. RNA polymerase 2 is de belangrijkste bij eiwit synthese. - DNA naar pre-mRNA naar mRNA naar eiwit. Transcriptie vindt plaats in de nucleus, translatie in het cytosol

RNA Synthese in eukaryoten. 1. Initiatie transcriptie a. TATA box wordt herkent door TFIID, vervolgens kan TFIIB binden die ook weer sequenties herkent op het DNA. b. Hierna worden nog andere transcriptie factoren aangeroepen waaronder TFIIH. TFIIH heeft helicase acriviteit waardoor dsDNA naar ssDNA gaat. uiteindelijk bindt ook RNA polymerase II. c. RNA polymerase II bevat een lange eiwitstaart (CTD). Deze is betrokken bij het processen van RNA en rekruteert hiervoor de benodigde eiwitten. d. Samen vormen al deze factoren het transcriptiecomplex. TFIIH plaatst fosfaatgroepen op de CTD van RNA polymerase II waardoor de RNA synthese kan beginnen. Na +- 10 nucleotides laten de meeste TFII’s los.

Voor de activatie van transcriptie moet het DNA loskomen van denucleosomen. Dit wordt gedaan door enhancer sequenties diebinden aan activator eiwitten waardoor het mediator complex kanbinden. Het mediator complex rekruteert eiwitten die onderandere histonen kunnen modificeren of chromatine kunnenremodellen voor een betere beschikbaarheid van- het DNA voor deRNA transcriptie. 2. Transcriptie a. Door plaatselijke ontwinding van het DNA ontstaat er super coiling: i. Negatieve supercoiling (voor transcriptie complex): dubbele helix wordt uit elkaar gedraaid waardoor het dreigt de bindingen los te maken  ontwinden van nieuw gemaakt RNA

ii. Positieve supercoiling (achter transcriptie complex): dubbele helix wordt strakker gedraaid waardoor deze moeilijker kan openen.  mechanische stress

Topoisomerase I helpt de mechanische stress minder te maken.Topoisomerase II helpt het uit de knoop halen van de verschillende strands 3. Capping en methylering a. Prokaryoten: een mRNA molecuul kan voor meerdere eiwitten coderen. Heeft daarom ook meerdere startcodons in de sequentie. Eukaryoten: eem mRNA molecuul codeert voor een eiwit. b. Aan de 5’ kant van het mRNA molecuul wordt een ‘cap’ gesynthetiseerd. Deze bestaat uit een gemethyleerd guanine die vast zit aan het mRNA met 3 fosfaten. Eerst wordt er een fosfaat aan de 5’ verwijderd, waarnaar GTP reageerd met de 2 overgebleven fosfaten. Uiteindelijk wordt een methylgroep vast gemaakt aan guanine die de 5’ cap compleet maakt. De capping vindt plaats nadat +- nulceotides zijn gevormd. c. Aan de 3 ‘kant van het mRNA molecuul wordt een poly-A start gesynthetiseerd. d. De poly-A staart en 5’ cap zeggen iets over de kwaliteit van splicing. Als dit process fout gaat zullen deze 2 concepten er maar (deels) zijn. 4. RNA splicing a. Splicing is het uitknippen van intronen in de mRNA sequentie. De belangrijkste componenten van splicing zijn de 5’ en 3’ splice sites, en de 2’oh groep op een A in de intron. b. Het karalyseren van splicing wordt gedaan door snRNP’s zoals U1 of U2 (aan een kant RNA component, aan de andere kant een eiwit component). Deze worden gerekruteerd door CTD.Een belangrijk evolutioneel voordeel van intronen is dat de splicing vanintronen niet altijd hetzelfde hoeft te zijn. Hierdoor kunnenverschillende sequenties van exonen onstaan. Dit betekent dus datsequenties die herkend moeten worden voor splicing zijn niet altijdprecies hetzelfde. Dit maakt alternatieve splicing mogelijk. Hierdoorkunnen uit een gen verschillende eiwitten worden gevormd.